MicroRNA-16调控BCL2表达和NF-κB1/MMP-9信号通路抑制胶质瘤生长和侵袭的机制研究

【摘要】胶质瘤是成人原发性脑肿瘤中最常见的类型之一，并且也是最具侵袭性和致死性的人类癌症类型之一。在过去的几十年中，越来越多的证据已经表明，微小RNA（miRNAs），一类非编码RNA，在神经胶质瘤中发挥关键作用。MicroRNA通过对靶向mRNA的降解和翻译水平的调控，从而在肿瘤的发生发展中起着原癌基因和抑癌基因的作用。通过对microRNA.org数据库和miRWalk数据库的分析，我们预测miR-16与人脑胶质瘤有着密切的关系。已有研究表明，miR-16在多种颅外恶性肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、肺癌以及慢性淋巴细胞白血病中表达异常减少，提示miR-16是具有抑癌作用的一类miRNA。人类神经胶质瘤的高度侵袭性是目前临床治疗神经胶质瘤的一个主要障碍。在分子水平上，肿瘤细胞侵袭与肿瘤细胞激活或促进肿瘤细胞的运动，基质的破坏，血管生成和其它生物事件密切相关。相关研究发现NF-κB介导了细胞增殖、细胞迁移和血管生成，在神经胶质瘤中存在异常激活，是肿瘤侵袭性的关键因素。P50作为NF-κB活化的核定位指标，在多形胶质母细胞瘤（GBM）的临床标本也被检测到。NF-κB信号传导通路通过诱导肿瘤细胞凋亡，细胞周期，和侵袭过程中的多种靶基因的转录从而调控了肿瘤的发生和发展。在NF-κB调节的所有基因中，基质金属蛋白酶（MMPs）与肿瘤的侵袭密切相关。在所有的基质金属蛋白酶，基质金属蛋白酶9（MMP9）和基质金属蛋白酶2（MMP2）的水平随着神经胶质瘤肿瘤恶性程度增而增加，因此被称为侵袭的关键酶。通过microRNA.org数据库分析miR-16和NF-κB1mRNA序列之间的同源性，我们发现15个核苷酸完全互补配对。因此，我们推测miR-16可能抑制NF-κB1和MMps蛋白质的表达，从而可能抑制或降低了神经胶质瘤侵袭能力。BCL2是一种致癌基因，其存在于线粒体中具有抗凋亡蛋白的作用，并且还与神经胶质瘤发展有着密切关系。在本研究中我们不仅要探讨miR-16在非瘤脑组织、不同级别的人脑胶质瘤组织以及三个恶性胶质瘤细胞系（SHG44,U87andU373）中的表达，以及miR-16和NF-κB1在同一人脑胶质瘤组织之间的表达的相关性，而且进一步通过体外和体内试验探讨miR-16与人脑胶质瘤细胞凋亡和侵袭性的相关性，为进一步深入研究miR-16在人类神经胶质瘤中的作用机制奠定基础。一、材料和方法1.通过对microRNA.org数据库和miRWalk数据库的分析，我们认为miRNA16(miR-16)与人脑胶质瘤和其他大多数人类肿瘤有着密切的关系。2.通过Lipofectamine2000脂质体法将化学合成miR-16寡核苷酸随机序列转染到恶性神经胶质瘤细胞株SHG44U87和U373中。为了实现稳定过表达的miR-16，本研究通过Lipofectamine2000脂质体法在人脑胶质瘤细胞U87中转染包含稳定表达pre-miR-16有寡核苷酸序列的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒。3.通过流式细胞仪和绿色荧光观察从而检测人脑胶质瘤细胞株SHG44、U87和U373的转染率。通过实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测miR-16和NF-κB1在非瘤脑组织和人脑胶质瘤组织标本中的表达。4.在人脑胶质瘤细胞株SHG44、U87和U373通过转染miR-16mimics、miR-16inhibitor和negativecontrololigonucleotide序列后，通过AnnexinVPEApoptosisDetectionKitPE和流式细胞仪检测细胞的早期凋亡率。通过划痕试验以及Transwell试验检测miR-16对人脑胶质瘤细胞SHG44、U87和U373侵袭能力的影响。5.通过Westernblot.检测NF-κB1、BCL2、MMP2和MMP9蛋白的表达。6.为了进一步在体内观察miR-16对胶质瘤侵袭和生长的影响，我们分别构建了过表达miR-16的U87细胞的颅内和皮下模型。HE染色和免疫荧光被用来检测miR-16在颅内标本中的侵袭能力。通过免疫组化检测miR-16、NF-κB1、MMP9和Ki-67的表达。通过荧光素酶实验验证NF-κB1和Bcl2为miR-16直接作用靶点。7.应用SPSS13.0软件进行数据分析，凋亡和侵袭实验的结果采用单因素方差分析，两组皮下裸鼠肿瘤体积的比较采用重复测量数据的方差分析。检验水准为α=0.05二、结果1.在人脑胶质瘤中miR-16与NF-κB1表达呈反相性相关。实时荧光定量PCR检测6例非瘤脑组织和29例人脑胶质瘤组织标本，其实验结果显示miR-16在原发人脑胶质瘤标本和胶质瘤细胞系中表达明显低于非瘤脑组织（P<0.01），并且随着肿瘤恶性程度的不断增加miR-16表达逐渐降低，低级别胶质瘤（Ⅰ，Ⅱ）与高级别胶质瘤(Ⅲ，Ⅳ)相比p<0.05；然而，随着人脑胶质细胞瘤恶性程度的增加NF-κB1表达却逐渐升高，低级别胶质瘤（Ⅰ，Ⅱ）与高级别胶质瘤(Ⅲ，Ⅳ)相比p<0.01，因此，在同一人脑胶质瘤标本中检测发现NF-κB1的mRNA表达与miR-16表达呈反向关系。2.在胶质瘤细胞中miR-16直接靶向调控NF-κB1的表达。通过microRNA.org数据分析miR-16和NF-κB1mRNA序列之间的同源性，发现15个核苷酸完全互补配对。通过荧光素酶实验检测证实miR-16直接靶向调控NF-κB1的3’UTR区域。应用qRT-PCR和Westernblottings实验检测NF-κB1mRNA和蛋白表达，数据显示miR-16过表达明显减少NF-κB1mRNA和蛋白的表达；同时下调miR-16的表达，NF-κB1表达增加。3.miR-16直接抑制了Bcl2蛋白表达，从而诱导了人脑胶质瘤细胞早期凋亡。通过microRNA.org数据库分析发现BCL2可能为miR-16的天然靶基因。本研究采用实时定量PCR检测miR-16的表达，同时采用Westernblotting检测BCL2的表达，结果发现在同一人脑胶质瘤标本中miR-16与BCL2的表达呈负相关。采用双荧光素酶报告基因检测证实miR-16明显抑制BCL2的3’UTR(p<0.05)。通过流式细胞仪技术检测发现，增加miR-16的表达能够诱导人脑胶质瘤细胞早期凋亡细胞的比例显著升高(P<0.01,n=3)。通过体外实验，对人脑胶质瘤细胞U87、U373和SHG44细胞分别转染miR-16mimics和inhibitors，通过Westernblotting检测BCL2的表达，其结果显示miR-16的过表达明显导致Bcl2蛋白表达的降低。4.在体外实验中miR-16的过表达明显降低了人脑胶质瘤细胞的侵袭能力。在本研究中，我们采用了划痕试验和Transwell试验，其实验结果显示过表达mir-16后，人脑胶质瘤细胞SHG44，U373和U87细胞的侵袭能力明显降低（p<0.01）。5.在体外实验中miR-16的过表达明显降低了MMP9的表达。通过Westernblottings检测侵袭相关基因MMP9和MMP2蛋白水平的表达。实验结果发现:在人脑胶质瘤细胞中miR-16过表达能够明显降低MMP9蛋白的表达，然而对MMP2蛋白的表达影响不明显。6.体内实验证实miR-16通过NF-κB1的靶向调节从而显著抑制人脑胶质瘤的生长，增殖和侵袭。通过人类神经胶质瘤的裸鼠颅内和皮下模型发现：在颅内肿瘤中，HE染色显示与阴性组相比，阳性组肿瘤边界明显，肿瘤体积明显较小；与阴性对照组相比，所有阳性组皮下肿瘤的生长受到明显抑制。免疫荧光显示miR-16降低了MMP9的表达并且抑制了胶质瘤的侵袭；免疫组化检测发现miR-16明显抑制了NF-κB1，MMP9和Ki-67的表达，其中阴性组Ki-67增殖指数为32.98%，阳性组Ki-67增殖指数为13.91%。三、结论在本研究中我们通过在体外和体内实验证实了miR-16作为肿瘤发生、发展负面调节器，进而调节了胶质瘤的生长和侵袭；在人脑胶质瘤中miR-16在原发人脑胶质瘤标本和胶质瘤细胞系中表达明显低于非瘤脑组织，并且随着肿瘤恶性程度的不断增加miR-16表达逐渐降低，在同一人脑胶质瘤组织标本中miR-16与NF-κB1表达呈反相性相关。在本研究中，我们证明了miR-16作为一个抑癌基因，通过调控BCL2表达和NF-kappaB1/MMP-9信号通路，从而抑制了人脑胶质瘤的生长和侵袭。本研究不仅为探索miR-16在人脑胶质瘤中的生长和侵袭方面的作用研究增加了一个新的理论认识，同时鉴于miR-16在人脑胶质瘤生长和侵袭中具有重要的作用，进而为miR-16有可能成为人脑胶质瘤治疗的分子靶标，也为miR-16有可能成为观察胶质瘤在放化疗方面疗效的指标提供新的理论依据。
【作者】杨天权；
【导师】周幽心；
【作者基本信息】苏州大学，神经外科学（专业学位），2014，硕士
【关键词】胶质瘤；miR-16；microRNA；NF-κB1；MMP9；BCL2；生长；侵袭；

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